Parmi les nombreuses uvres que, selon Vasari, Piero a peint à Pérouse, l'historien a décrit avec beaucoup d'admiration le polyptyque commandé par les religieuses du couvent de Saint Antoine de Padoue.
Ce tableau complexe, aujourd'hui conservé à la Pinacothèque Nationale de Pérouse, a été commencé peu après le retour de Piero de Rome, mais n'a pas été achevé que quelques années plus tard.
La partie centrale de la composition date probablement des années 1460, la Vierge et l'Enfant avec Saint Antoine et saint Jean-Baptiste, saint François et Elisabeth, est influencé par la peinture espagnole que Piero a eut l'occasion de voir à Rome.
Les trois panneaux de la prédelle montrent St Antoine de Padoue qui ressuscite un enfant, la stigmatisation de saint François et St Elisabeth sauvant un garçon qui est tombé à ses pieds.
La qualité de cette prédelle est extraordinaire : Piero a expérimenté le rendu de l'espace sur ces tableaux de petites dimensions en accentuant la blancheur des murs auxquelles répondent les zones lumineuses dans la profondeur de la nuit de la scène d'extérieure. Les corps ainsi que les ombres rendus dans leurs trois dimensions, influenceront notablement les artistes italiens de la deuxième moitié du 15ème siècle, le Pérugin et Antonello de Messine notamment
Quelques années plus tard, Piero della Francesca achève le polyptyque en peignant, au-dessus du polyptique, une extraordinaire Annonciation.